BioLector結(jié)合 PI 染色法進行細胞裂解、細胞應(yīng)激及毒性篩選的具體應(yīng)用。

方法

大腸桿菌培養(yǎng)：采用 BioLector進行大腸桿菌 Bl21（DE3）菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度 37° C，振搖速度 800 rpm），微孔板為 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板（MTP），每孔填樣體積為800µL。培養(yǎng)基為緩沖液濃度為 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。

PI 濃度：將 1mM PI 染色液溶于磷酸鹽緩沖液中配制 PI 原液。此原液需無菌過濾并在 4° C 下儲存。PI 嵌入 DNA 時，為避免對用戶造成傷害，培養(yǎng)基中的最終 PI 濃度不應(yīng)過高。在本應(yīng)用指南中，培養(yǎng)基最終 PI 濃度應(yīng)為 5 µM。

誘導(dǎo)細胞死亡：在此培養(yǎng)案例中，通過在 7 小時后將培溫度提升至 50°C或加入純甲醇（MeOH）來誘導(dǎo)細胞死亡。

測定死亡細胞：誘導(dǎo)細胞死亡后，PI 滲入細胞膜破裂的細胞與 DNA 結(jié)合，導(dǎo)致熒光偏移，然后通過PI 濾光片模塊檢測死亡細胞的熒光信號。

結(jié)果

細胞毒性篩選：采用 BioLector 進行PI 染色和檢測進行細胞毒性篩選。添加 MeOH 對大腸桿菌 BL21（DE3）進行應(yīng)激培養(yǎng)，如下圖所示。

不同濃度的MeOH作為應(yīng)急因素對大腸桿菌培養(yǎng)的細胞毒性篩選

培養(yǎng) 7 小時后，添加 27%v/v MeOH 時生長停滯，可通過散射光信號和 DO 信號檢測得出：添加 MeOH 后 DO 信號立即增至初始值（100 %），表明細胞開始凋亡。添加 9%v/v MeOH 導(dǎo)致散射光信號減弱，表明生長斜率下降與 DO 信號相呼應(yīng)。18 小時后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的細胞最終 PI 信號分別為 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。該結(jié)果對5µM PI培養(yǎng)基進行了空白扣除。

細胞裂解的測定：如圖所示，培養(yǎng) 7 小時后，將溫度從 37° C 提升至 50°C 以誘導(dǎo)細胞裂解。散射光信號表明，經(jīng) 5 µM PI 處理的大腸桿菌未進一步生長，熱處理 1 小時后對照組也未進一步生長。未經(jīng)熱處理大腸桿菌（+ 5µM PI）的生長曲線顯示，細菌在 11 小時前呈指數(shù)增長，之后進入穩(wěn)定期。熱處理后大腸桿菌停止生長，2 小時后，細胞開始裂解，因此 PI 信號呈線性增強，并約在培養(yǎng) 14 小時后達到飽和。之所以延遲 2 小時，是因為熱量在液體中分布并作用于細胞需要時間。未經(jīng)熱處理組的 PI 曲線在指數(shù)生長期可觀察到背景熒光信號。

采用BioLector 通過 PI 染色測定細胞裂解

應(yīng)激細胞測定：在正在進行的培養(yǎng)實驗中，散射光和 PI 信號的結(jié)合有助于識別應(yīng)激細胞。在以下案例中，大腸桿菌BL21 分別在兩種不同 MOPS 緩沖液濃度的 Wilms-MOPS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。下圖表示散射光、DO 信號、pH 值和 PI 信號隨培養(yǎng)時間變化的實驗結(jié)果。更多解析請見應(yīng)用指南《利用BioLector進行細胞死亡的測定》。

采用 BioLector通過 PI 測量應(yīng)激細胞

從上述應(yīng)用可以看到貝克曼庫爾特 BioLector高通量微生物反應(yīng)器，不僅可以進行48個樣品的高通量發(fā)酵，同時在線參數(shù)檢測、補料和PH調(diào)控，從而實現(xiàn)高通量菌種篩選和工藝優(yōu)化，而且結(jié)合 PI 染色法可以進行細胞裂解、細胞應(yīng)激及毒性篩選的測定。