Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀最少僅需170uL樣品體積即可得到細(xì)胞密度和活率結(jié)果。為了準(zhǔn)確分析不同細(xì)胞，Vi-CELL BLU提供了創(chuàng)建和優(yōu)化自定義Cell Type設(shè)置的功能。本文我們拿容易團(tuán)聚的HEK293細(xì)胞給大家介紹下Cell Type的設(shè)置是如何影響樣品的處理和圖像分析。

在分析團(tuán)聚細(xì)胞時(shí)，Cell Type設(shè)置中首先會(huì)使用到的參數(shù)是Decluster degree，我們可以設(shè)置為None，Low，Medium或High，并且使用更靠后的值會(huì)增加軟件對(duì)團(tuán)聚細(xì)胞的識(shí)別能力。

當(dāng)出現(xiàn)過(guò)多的團(tuán)聚，我們還需要考慮增加對(duì)樣品的Aspiration和Mixing Cycles次數(shù)。在每次Aspiration過(guò)程中，細(xì)胞樣品會(huì)在樣品管和注射器之間來(lái)回吹打混懸。對(duì)于那些很難混懸分散或傾向于粘到樣品杯壁上的細(xì)胞樣品，建議使用這種方法。在Mixing Cycle過(guò)程中，臺(tái)盼藍(lán)和細(xì)胞樣品一起在樣品管和注射器之間來(lái)回混勻。增加Mixing Cycles次數(shù)會(huì)讓臺(tái)盼藍(lán)混勻地更好。Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀的設(shè)計(jì)降低了剪切力對(duì)細(xì)胞的傷害。另外，低剪切力可以提高結(jié)果的重現(xiàn)性。但增加Aspiration或Mixing Cycles會(huì)提高額外剪切力，從而對(duì)比較脆弱的細(xì)胞產(chǎn)生潛在的危害。但是，對(duì)于團(tuán)聚細(xì)胞系，這些額外的剪切力則可以用于破壞細(xì)胞的團(tuán)聚。

Decluster degree和Aspiration/Mixing Cycles之間重要的區(qū)別在于它們是在哪個(gè)時(shí)刻影響的分析結(jié)果。Decluster degree只對(duì)測(cè)試結(jié)束后保存在軟件上的細(xì)胞照片根據(jù)不同設(shè)置的Decuster degree重新進(jìn)行分析。而Aspiration和Mixing Cycles是在拍照前對(duì)細(xì)胞樣品就產(chǎn)生了影響，測(cè)試結(jié)束后無(wú)法再修改Aspiration和Mixing Cycles數(shù)值，得到再分析的結(jié)果。

因此，優(yōu)化Cell Type對(duì)于得到好的結(jié)果很重要，本文中對(duì)于團(tuán)聚細(xì)胞分析，如何調(diào)整Cell Type提供了一些指導(dǎo)。

團(tuán)聚的細(xì)胞懸液也是細(xì)胞培養(yǎng)條件欠佳的指標(biāo)，包括但不限于過(guò)度消化、環(huán)境應(yīng)激、過(guò)度生長(zhǎng)和污染。細(xì)胞團(tuán)聚限制了細(xì)胞對(duì)資源和可用增殖空間的獲取。這將阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)，降低通量，并影響下游分析結(jié)果，譬如像流式細(xì)胞儀分析方法需要單細(xì)胞溶液。此外，ISO 20391-1(4)中聲明，為了獲得最佳計(jì)數(shù)結(jié)果（與所使用的分析方法無(wú)關(guān)），需要單細(xì)胞懸浮液，并且需要正確的樣品制備流程。Vi-CELL BLU 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀用紅色框標(biāo)記（非常）大的細(xì)胞團(tuán)。由于對(duì)大細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行計(jì)數(shù)容易出錯(cuò)，因此這些大細(xì)胞團(tuán)不會(huì)進(jìn)行去團(tuán)聚處理，并會(huì)自動(dòng)從計(jì)數(shù)中排除。這些大細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量可以在結(jié)果文件的“Cluster Count"中找到，這是培養(yǎng)物中細(xì)胞團(tuán)聚的良好指標(biāo)。如果觀察到細(xì)胞團(tuán)較多時(shí)，建議進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件或進(jìn)行樣品處理。

這些實(shí)驗(yàn)中使用的是FreeStyle 293-F 細(xì)胞（Thermo Fisher，Cat.編號(hào)：R79007）。將 HEK 懸浮細(xì)胞在含有FreeStyle 293（30 mL）表達(dá)培養(yǎng)基的 50 mL Falcon 管中培養(yǎng)，每 3-4 天傳代培養(yǎng)一次，接種細(xì)胞密度為 0.2x10⁶ 個(gè)細(xì)胞/mL。它們?cè)?37°C、250 rpm 和 5% CO₂ 濃度下孵育。

使用培養(yǎng) 4 天的細(xì)胞樣品進(jìn)行初始測(cè)量，在Normal模式下使用Mammalian Cell Type重復(fù)測(cè)量 5 次。然后結(jié)果被導(dǎo)出（每 10 張圖像照片保存一張）并離線重新分析。為了重新分析，基于默認(rèn)的Mammalian Cell Type創(chuàng)建了另外兩個(gè)Cell Type，但將去團(tuán)聚度設(shè)置為L(zhǎng)ow和High。為了研究不同去團(tuán)聚度設(shè)置的有效性，比較了這三種Cell Type總細(xì)胞密度和活細(xì)胞密度以及活率的結(jié)果。

之后，開(kāi)始用 HEK 293-F 細(xì)胞進(jìn)行新鮮培養(yǎng)，并在第 0、1、2、3 和 6 天取樣。然后，測(cè)試了其他采樣參數(shù)，因?yàn)樗腥掌诘臉悠范加媚J(rèn)的Mammalian Cell Type，以及將Aspiration和Mixing Cycles增加到10次的Cell Type。在所有采樣日，將細(xì)胞培養(yǎng)液用 5 mL 移液器混合 2 次，然后將 5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到 15 mL  Facon管中。接著，用 1000 μL 移液器將樣品再混合 3 次，再將 3 x 500 μL 細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL XR 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀樣品管中，以及將 6 x 200 μL 細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到 Vi-CELL BLU 96 孔板中。Vi-CELL XR 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上的樣品，使用圖 1 所示的Cell Type分析；在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上，兩種Cell Type交替進(jìn)行。然后，將 2 x 10 μL 細(xì)胞樣品與臺(tái)盼藍(lán) 1:1 混合并轉(zhuǎn)移到一次性血球計(jì)數(shù)板中手動(dòng)計(jì)數(shù)。

圖1：Vi-CELL XR上的分析設(shè)置，選擇的設(shè)置類似于Vi-CELL BLU上的設(shè)置

然后，在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上運(yùn)行的樣品以High Decluster degree重新分析，在 Vi-CELL BLU 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上共生成4種不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以與 Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀的結(jié)果和手動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較。

表1. Vi-CELL BLU分析HEK 293-F的Cell Type，Mammalian Cell Type作為其他3個(gè)Cell Types的模板。

在三個(gè)Decluster degree下（Low，Normal和High）得到的平均總細(xì)胞密度和活細(xì)胞密度（分別為 TCD 和 VCD）和活率進(jìn)行了比較（圖2）。更高的去團(tuán)聚度使得TCD 和 VCD 值均明顯增加（R2 > 0.98）。然而，使用較低或較高的Decluster degree時(shí)，細(xì)胞活率卻并不顯著增加或減少。

圖2：Vi-CELL BLU使用不同Decluster degree設(shè)置分析HEK 293-F的結(jié)果。平均總細(xì)胞和活細(xì)胞密度顯示在左軸上，平均活率顯示在右軸上。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

表 2 中的圖像顯示了Decluster degree如何影響樣品分析，從而影響細(xì)胞濃度結(jié)果。所選圖像是圖2中其中一個(gè)測(cè)量樣品的圖像（部分），并且很好地表示了細(xì)胞樣品的狀態(tài)。如前所述，HEK 293 F細(xì)胞傾向于形成團(tuán)聚體，而這些團(tuán)聚體中的細(xì)胞可能難以計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。當(dāng) Decluster degree 設(shè)置為 low 時(shí)，某些團(tuán)聚將不再被解聚，并且標(biāo)有藍(lán)色圓圈，表示Vi-CELL軟件錯(cuò)誤地將它們識(shí)別為單個(gè)顆粒，因?yàn)槠涑叽巛^大，根據(jù)所選Cell Type參數(shù)未歸為一個(gè)細(xì)胞。通過(guò)更高的去團(tuán)聚度，可以分析更多這些團(tuán)聚細(xì)胞，從而產(chǎn)生單個(gè)團(tuán)聚標(biāo)記為Normal Decluster degree，所有團(tuán)聚細(xì)胞均在High declustering下進(jìn)行分析。更高的Decluster degree設(shè)置會(huì)導(dǎo)致識(shí)別出額外的細(xì)胞，可能導(dǎo)致人為地提高細(xì)胞密度，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞可能（幾乎）分裂成兩個(gè)或多個(gè)顆粒。這些顆粒是被忽略還是算作活細(xì)胞或死細(xì)胞取決于其他Cell Type參數(shù)，例如大小、圓度和亮度。因此，優(yōu)化Cell Type設(shè)置對(duì)于獲得準(zhǔn)確的結(jié)果很重要。

表2. 不同Decluster degree設(shè)置的分析結(jié)果，隨著Declustering增加，更多的細(xì)胞團(tuán)聚被分析，細(xì)胞團(tuán)聚體中更多的細(xì)胞被識(shí)別。

請(qǐng)注意，Cluster count不受Decluster degree的影響。對(duì)于“Low"和“High"設(shè)置，每次測(cè)量平均計(jì)數(shù) 1.6 個(gè)Clusters。Cluster count指示在樣本中發(fā)現(xiàn)了多少個(gè)過(guò)大的細(xì)胞團(tuán)聚體。這些Cluster用紅色框標(biāo)記，并且無(wú)論Decluster degree如何，都全部排除在分析之外。因此，高的Cluster count是大細(xì)胞團(tuán)聚體的良好指示，需要在培養(yǎng)處理或樣品制備方面進(jìn)行額外優(yōu)化，以獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

最終，在優(yōu)化Cell Type設(shè)置時(shí)，Vi-CELL BLU 軟件還提供了增加Aspiration和Mixing cycles的可能性。增加Aspiration和Mixing的影響評(píng)估，是使用默認(rèn)的Mammalian Cell Type，將其中的Aspiration和Mixing cycles都設(shè)為10，每天對(duì) HEK 293-F 細(xì)胞樣品進(jìn)行采樣，并一式三份測(cè)定細(xì)胞密度。之后，使用表1所述的High Decluster degree重新分析所有測(cè)量值。將結(jié)果與使用Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀及手動(dòng)計(jì)數(shù)獲得的值進(jìn)行比較（圖3）。

圖3: Vi-CELL BLU用4種不同Cell Types檢測(cè)的總細(xì)胞密度和活率（藍(lán)-灰色），Vi-CELL XR（紅色）和手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)（綠色）。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

圖 3 顯示了 Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀、血球計(jì)數(shù)板、Vi-CELL BLU 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀（使用默認(rèn)Mammalian Cell Type）測(cè)試6天得到的細(xì)胞密度和活率具有可比性。此外，Mixing增加和/或High declustering的Cell Type會(huì)導(dǎo)致更高的細(xì)胞密度。在第3天，測(cè)量的平均 TCD 介于 2.81 – 4.12 百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL 之間，分別使用默認(rèn)的 Mammalian 和 Mammalian A10M10  High decluster。因此，與默認(rèn)設(shè)置相比，更改兩個(gè)參數(shù)后結(jié)果增加了 47%。

然而，在第6天存活率下降到~70%，而且手動(dòng)計(jì)數(shù)的TCD明顯比自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的TCD更高。表 3 中的圖像（通過(guò)顯微鏡顯示 Neubauer 分析室）為這種偏差提供了清晰地解釋，因?yàn)榕c第 3 天相比，第 6 天的細(xì)胞樣品中顯示有更多的細(xì)胞聚集體。這些細(xì)胞聚集體很難計(jì)數(shù)，在分析過(guò)程中大的團(tuán)聚細(xì)胞將被全部忽略。

表3: 第3和第6天HEK 293-F細(xì)胞計(jì)數(shù)顯微鏡下的照片。第6天可以看到更多的細(xì)胞團(tuán)聚體，細(xì)胞活率降低。

專注于培養(yǎng)的前 3 天（圖 4）可以進(jìn)一步研究不同的Cell Type設(shè)置如何影響計(jì)數(shù)結(jié)果。第 3 天血球計(jì)數(shù)板圖像（表 3）顯示，到目前為止，細(xì)胞主要以小聚集體或單細(xì)胞形式生長(zhǎng)。仔細(xì)觀察Cluster count可以發(fā)現(xiàn)，Clusters的平均數(shù)量從第 1 天的 0.7 個(gè)增加到第 2 天的 3.7 個(gè)和第 3 天的 8.7 個(gè)。同時(shí)，更高的Mixing和Aspiration cycles的效果似乎有所增加，第 1 天的 TCD 增加了 4%，而第 2 天和第 3 天分別增加了 17% 和 25%。在Mammalian A10M10 High decluster設(shè)置下的結(jié)果一直是最高濃度。

圖4: HEK培養(yǎng)的前3天。在 Vi-CELL BLU 上以藍(lán)灰色以及 Vi-CELL XR（紅色）和手動(dòng)計(jì)數(shù)（綠色）測(cè)定四種不同的細(xì)胞密度和活率。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

總之，每日采樣結(jié)果進(jìn)一步證明了正確Cell Type設(shè)置的重要性。僅改變?nèi)齻€(gè)參數(shù)就導(dǎo)致 TCD 增加 47%。測(cè)量團(tuán)聚的HEK細(xì)胞時(shí)，調(diào)整Decluster degree和Mixing/Aspiration cycles可以得到更高的TCD。然而，第6天的數(shù)據(jù)（圖3）表明，應(yīng)避免過(guò)度團(tuán)聚的細(xì)胞樣品，因?yàn)榕c手動(dòng)計(jì)數(shù)相比，所有Cell Type的結(jié)果都明顯較低。

本文討論了使用 Vi-CELL BLU 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀優(yōu)化細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的幾種選擇。除了優(yōu)化一般的培養(yǎng)處理 - 這將改善細(xì)胞健康、通量和產(chǎn)率 – 可以通過(guò)調(diào)整樣品處理和分析來(lái)改進(jìn)。通過(guò)演示使用不同Cell Type設(shè)置的影響，可以清楚地看出針對(duì)所用細(xì)胞系和應(yīng)用優(yōu)化這些設(shè)置對(duì)于獲得好的分析結(jié)果至關(guān)重要。

在處理傾向于形成聚集體的細(xì)胞系時(shí)，對(duì)Decluster degree、Aspiration cycles和Mixing cycles的擬議更改是優(yōu)化計(jì)數(shù)性能的良好起點(diǎn)。但是，當(dāng)可能需要進(jìn)一步優(yōu)化時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)向貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)的相關(guān)技術(shù)人員尋求支持。