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5小時(shí)搞定AAV空殼/實(shí)心分離!「OptiMATE梯度大師」放大攻略來(lái)了!

點(diǎn)擊次數(shù):241 更新時(shí)間:2025-11-24
5小時(shí)搞定AAV空殼/實(shí)心分離!「OptiMATE梯度大師」放大攻略來(lái)了!




AAV基因療法火不火,關(guān)鍵就看「實(shí)心衣殼」純不純。CsCl密度梯度超離(DGUC)仍是金標(biāo)準(zhǔn),但16-20 h的離心時(shí)間讓人頭大。貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)推出OptiMATE「預(yù)制梯度」方案,把4×39 mL(Type 70Ti)跑樣時(shí)間壓到5小時(shí)。


方法大揭秘!5小時(shí)內(nèi)搞定高純度AAV腺相關(guān)病毒純化




今天我們把同樣的速度搬進(jìn)了更大容量轉(zhuǎn)子

Type 50.2Ti(468 mL)

和Type 45Ti(564 mL)

放大不翻車!









實(shí)驗(yàn)如何操作?









01

實(shí)驗(yàn)一:預(yù)制梯度vs自形成梯度


  • OptiMATE自動(dòng)分液灌裝線性CsCl梯度(1.15-1.55 g/mL)→離心4 h;

  • 手工灌均一液(1.35 g/mL)→20 h自形成梯度。


02

實(shí)驗(yàn)二:AAV樣本加載


  • 39 mL管:2×1013 vg AAV9;

  • 94 mL管:4×101? vg AAV9。


03

離心參數(shù):


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04

實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比:



實(shí)驗(yàn)一:

梯度曲線幾乎重疊,預(yù)形成4 h=自形成20 h分辨率。

Type 50.2轉(zhuǎn)子中39 mL Quick-Seal管(上圖)與Type 45Ti轉(zhuǎn)子中94 mL Quick-Seal管(下圖)的密度梯度曲線對(duì)比。

  • 圖中紅色曲線為OptiMATE梯度制備儀分配的預(yù)成型CsCl密度梯度離心4小時(shí)結(jié)果,

  • 黑色曲線為手工分配的均質(zhì)CsCl密度梯度自成型離心20小時(shí)結(jié)果。

  • 誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差。

  • 藍(lán)色與紅色條帶分別表示空衣殼與完整衣殼的預(yù)期位置范圍。


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圖1



實(shí)驗(yàn)二:

AAV純化條帶實(shí)拍:AAV空殼/實(shí)心條帶銳利,5 h即可手動(dòng)側(cè)抽回收(圖2)

5小時(shí)搞定AAV空殼/實(shí)心分離!「OptiMATE梯度大師」放大攻略來(lái)了!

圖2:分別展示自成型密度梯度離心20小時(shí)與預(yù)成型密度梯度離心5小時(shí)后的結(jié)果,左為39 mL管,右為94 mL管


自成型密度梯度管與預(yù)成型密度梯度管之間的條帶輪廓存在差異,特別是在部分填充與完整衣殼條帶的銳度(即清晰度)以及這些條帶與空衣殼條帶之間的分離度方面。然而,空衣殼條帶與完整衣殼條帶之間的分離程度仍足以通過(guò)視覺(jué)觀察并通過(guò)注射器穿刺提取。



實(shí)驗(yàn)三:

分析型超離驗(yàn)證實(shí)心AAV純度≈90%,時(shí)間節(jié)省75%

使用分析型超速離心AUC進(jìn)行確認(rèn),從預(yù)成型梯度中回收的完整衣殼純度為90%,盡管超速離心時(shí)間顯著縮短至5小時(shí)。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)成型密度梯度,有望實(shí)現(xiàn)空衣殼、部分填充衣殼與完整衣殼之間更清晰的視覺(jué)分離。










結(jié)論









通過(guò)「預(yù)形成梯度+大容量轉(zhuǎn)子」把AAV空殼純化從2天壓到半天,放大不掉分辨率,OptiMATE梯度大師為基因治療CMC提速!

  • Type 45Ti:一次8×94 mL=752 mL,比傳統(tǒng)70Ti多出80%通量;

  • Type 50.2Ti:12×39 mL=468 mL,管數(shù)多50%,抽提步驟更少;

  • 全程封閉灌梯度→減少人為誤差,GMP場(chǎng)景友好


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